胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，用于降解細(xì)胞間結(jié)合蛋白從而使細(xì)胞脫離其培養(yǎng)介質(zhì)，令細(xì)胞之間相互進(jìn)行分散。胰蛋白酶大致可以分為兩種，一種是傳統(tǒng)使用的動(dòng)物源性的胰蛋白酶，主要提取自?；蜇i的胰腺組織；另一種則是非動(dòng)物源性胰酶，即利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的重組胰蛋白酶。

動(dòng)物源胰蛋白酶的潛在憂患

早期的胰蛋白酶是從牛、豬、羊的胰臟中提取，通過(guò)多重結(jié)晶方式純化，并進(jìn)一步采取層析及超濾技術(shù)制備而得。該酶易溶于水，不溶于三氯甲烷、乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。最初胰蛋白酶在生物制藥的主要應(yīng)用是胰島素的生產(chǎn)，后期也在疫苗制備、細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域中應(yīng)用起來(lái)。但動(dòng)物源的胰蛋白酶具有極大的潛在風(fēng)險(xiǎn)，其自身可能攜帶大量可感染人的病毒，例如：瘋牛病的牛帶有的BSE病毒，豬的口蹄疫病毒，可在人和動(dòng)物之間傳播的禽類流感病毒等。

這樣的情況可不少：上世紀(jì)60年代于脊髓灰質(zhì)炎疫苗中檢測(cè)到SV40病毒，在減毒黃熱活疫苗中發(fā)現(xiàn)禽白血病病毒。2010年，Merck和GSK公司已上市的輪狀病毒疫苗中又先后檢測(cè)到豬圓環(huán)病毒核酸序列。據(jù)當(dāng)時(shí)科學(xué)家推測(cè)，導(dǎo)致這種情況的“元兇”可能是疫苗生產(chǎn)所必需的細(xì)胞在增殖的過(guò)程中所用的豬胰蛋白酶造成。因此，如何提高生物制品的安全性成為了監(jiān)管層的關(guān)注重點(diǎn)。

重組胰蛋白酶時(shí)代

2019年9月國(guó)家藥監(jiān)局發(fā)布了《疫苗上市后生產(chǎn)工藝變更研究技術(shù)指導(dǎo)原則》（征求意見稿）：“生產(chǎn)過(guò)程中，應(yīng)盡可能避免使用人源或動(dòng)物源性原材料”，疫苗生產(chǎn)原輔料變更，將動(dòng)物源性的牛血清或胰酶變更為無(wú)動(dòng)物源的原輔料，只需要通過(guò)簡(jiǎn)化變更流程，鼓勵(lì)企業(yè)進(jìn)行無(wú)動(dòng)物源原輔料的變更。2020年版《中國(guó)藥典》也增加了重組胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)。

重組胰蛋白酶的氨基酸序列與動(dòng)物源提取的胰蛋白酶一致，該酶包含兩種胰蛋白酶活性形式：α-胰蛋白酶和β-胰蛋白酶。其活性受絲氨酸蛋白酶抑制劑如PMSF和TLCK等、金屬離子螯合劑如EDTA等的抑制。在應(yīng)用上，可替代傳統(tǒng)胰蛋白酶用于疫苗、干細(xì)胞、免疫細(xì)胞治療、胰島素生產(chǎn)等對(duì)動(dòng)物來(lái)源材料有嚴(yán)格限制的生物制藥產(chǎn)業(yè)。

藥典級(jí)別的重組胰蛋白酶要求微生物的菌落總數(shù)不超過(guò)100cfu/mL，宿主蛋白質(zhì)殘留量不超過(guò)0.01%，外源性DNA殘留量不超過(guò)10ng/mg。由上表可以看出，相比傳統(tǒng)動(dòng)物源提取的胰蛋白酶，重組胰蛋白酶在活性、純度以及無(wú)動(dòng)物源性等方面優(yōu)勢(shì)更為明顯，更符合生物制藥行業(yè)發(fā)展趨勢(shì)。

生物制藥無(wú)動(dòng)物源性（AOF）的需求

在疫苗細(xì)胞基質(zhì)制備中胰蛋白酶是常用的原料，而動(dòng)物源性胰蛋白酶內(nèi)一些能引起人畜共患病的潛在病毒都有可能帶入終產(chǎn)品中。

隨著SARS，H1N1，禽流感等病毒影響下，為了減少已知污染物和未知污染，相關(guān)法規(guī)已有明確要求，如在藥物標(biāo)簽上注明是否應(yīng)用動(dòng)物源的原料，生物制藥公司促使原料生產(chǎn)商在選擇原料的時(shí)候提高對(duì)AOF的關(guān)注度；所有用血液和血漿來(lái)源的藥物制品在標(biāo)簽上注明：警告病毒和阮病毒疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

作為制藥輔料的用酶—制訂新版重組酶的標(biāo)準(zhǔn)將包括胰蛋白酶、胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，膠原酶等，其中第一個(gè)給出標(biāo)準(zhǔn)的就是重組胰蛋白酶。

金普諾安|重組胰蛋白酶

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金普諾安重組胰蛋白酶是由微生物基因重組表達(dá)生產(chǎn)，氨基酸序列與豬胰腺來(lái)源的胰蛋白酶一致，且具有與動(dòng)物源性豬胰蛋白酶相同的酶學(xué)性質(zhì)，可替代豬胰腺來(lái)源胰蛋白酶應(yīng)用于各種生物技術(shù)過(guò)程中，如：重組胰島素生產(chǎn)、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞發(fā)酵、蛋白質(zhì)的酶解以及各種組織的細(xì)胞分離等。胰蛋白酶活性受絲氨酸蛋白酶抑制劑如PMSF等的抑制，金屬離子螯合劑如EDTA等也能抑制酶活。

檢測(cè)數(shù)據(jù)

1.產(chǎn)品純度：

結(jié)論：檢測(cè)結(jié)果分析，β-Trypsin的含量可達(dá)70%以上，符合2020版中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)。

2.凍融穩(wěn)定性測(cè)試

結(jié)論：產(chǎn)品分別在經(jīng)過(guò)不同次數(shù)凍融后均未觀察到酶活性損失。

3.溫度穩(wěn)定性測(cè)試

結(jié)論：產(chǎn)品在4℃或室溫避光條件下4周內(nèi)活性未降低；在4℃條件下5個(gè)月內(nèi)活性未降低。

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