近年來，基因治療領(lǐng)域取得了顯著的突破，腺相關(guān)病毒（AAV）成為了備受矚目的基因治療載體。AAV載體具有不整合宿主基因組、靶向組織特異性等核心優(yōu)勢成為常見及有效的基因治療遞送載體之一。國外AAV基因療法已取得了不錯(cuò)的商業(yè)化進(jìn)展，已有幾款A(yù)AV基因療法藥物獲批上市。隨著AAV研究從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模轉(zhuǎn)向臨床生產(chǎn)，需要面臨上游生產(chǎn)和下游純化過程的諸多重要挑戰(zhàn)，以確保AAV產(chǎn)品的充足供應(yīng)。

AAV病毒生產(chǎn)與純化挑戰(zhàn)

AAV病毒載體的生產(chǎn)流程主要包含三個(gè)部分，分別為上游環(huán)節(jié)、下游環(huán)節(jié)和制劑及灌裝環(huán)節(jié)。上游環(huán)節(jié)是指AAV載體的生產(chǎn)階段。下游環(huán)節(jié)是指通過分離、純化手段，達(dá)到去除雜質(zhì)、得到預(yù)期純度AAV載體的階段。制劑及灌裝環(huán)節(jié)指在保證產(chǎn)品性狀穩(wěn)定的前提下，確定合適的制劑組成與劑量，并完成灌裝。

上游生產(chǎn)得到的AAV顆粒都需要進(jìn)一步純化，因此下游處理步驟占病毒生產(chǎn)總成本的很大一部分，且難度很大，特別是純化過程，因此有效地制備高純度病毒的方法至關(guān)重要。

圖源攝圖網(wǎng)（已獲授權(quán)）

近些年，研發(fā)人員開發(fā)了多種AAV下游純化方法。以下為典型的純化流程，包括：細(xì)胞裂解——核酸去除——層析純化前，去除細(xì)胞碎片-親和層析去除宿主細(xì)胞蛋白（HCPs）和任何血清蛋白雜質(zhì)——超速離心程序或離子交換層析，分離包含完整基因的傳染性病毒與空的非傳染性病毒——純化。

▲ 典型AAV下游工藝示意圖（來源：公開網(wǎng)站）

在裂解細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的宿主DNA、RNA及其它游離DNA等核酸被釋放了出來，這些核酸污染物會(huì)降低AAV制備物的純度，影響療效和安全性。為了解決這一問題，研究人員采用了多種方法，其中之一是應(yīng)用廣譜核酸酶。

廣譜核酸酶在AAV生產(chǎn)中的應(yīng)用

廣譜核酸酶，又稱全能核酸酶，在功能上，它能夠剪切各種形式DNA和RNA，無論是單鏈、雙鏈、線狀、環(huán)狀或超螺旋形式的DNA和RNA，切斷磷酸二酯鍵從而產(chǎn)生5’-磷酸核苷酸或5’-磷酸寡核苷酸。

根據(jù)WHO和各國藥物注冊監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求，生物制劑中殘留的宿主DNA的劑量通常不得超過100 pg/劑量，部分特殊情況下不得高于10 ng/劑量。在AAV病毒生產(chǎn)中，由于大規(guī)模細(xì)胞擴(kuò)增，細(xì)胞裂解液中往往含有大量的宿主細(xì)胞DNA和RNA。因此，常使用廣譜核酸酶應(yīng)用于生產(chǎn)工藝流程中來有效降低宿主細(xì)胞DNA（HCDNA）殘留超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)。

在AAV病毒的生產(chǎn)和純化過程中，正確使用廣譜核酸酶至關(guān)重要。這里包括：反應(yīng)溫度、體系、時(shí)間、酶的濃度、停止反應(yīng)條件等多種因素，關(guān)于如何使用可以參考之前發(fā)布的干貨分享|?廣譜核酸酶的使用，你學(xué)會(huì)了嗎？一文中就有詳細(xì)描述。

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金普諾安|廣譜核酸酶

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高度穩(wěn)定性

比活性大于 1000 KU/mg 蛋白

無動(dòng)物源性成分

避免原核細(xì)胞的內(nèi)毒素污染

不含蛋白酶殘留

供應(yīng)穩(wěn)定，到貨快

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【產(chǎn)品數(shù)據(jù)】-純度檢測

√ 純度≥90%（Native-PAGE）

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【產(chǎn)品數(shù)據(jù)】-蛋白酶污染測定

√ 未檢測到蛋白酶活性

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結(jié)語：廣譜核酸酶在AAV病毒生產(chǎn)和純化中是解決DNA和RNA污染物問題的重要工具。通過正確使用廣譜核酸酶，研究人員可以提高AAV制備物的純度和質(zhì)量，從而為基因治療和生物醫(yī)學(xué)研究提供高質(zhì)量的AAV樣品。隨著這一領(lǐng)域的不斷發(fā)展，我們有望看到更多創(chuàng)新的方法和技術(shù)優(yōu)化來降低直接成本。